انواع محیط های کشت باکتری

محیط های کشت

کشت وتکثیر باکتریها در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت-رطوبت کافی- نمک- PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیژن می باشد. محیط های کشت را متناسب با نوع آزمایش می‏توان به دو صورت مایع و جامد تهیه کرد.

                 

۱- محیط کشت مایع :

 محیط های مایع به علت نداشتن آگار در ترکیب خود به صورت جامد در نیامده و متناسب با نوع میکروارگانیسم و آزمایشهای مورد نظر می‏توان آنها را در لوله‏های آزمایش ـ ارلن مایر و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد.

 ۲.محیط کشت جامد :                

 محیط های جامد  به علت دارا بودن آگاردر ترکیب خود به صورت جامد بوده و متناسب با میکروارگانیسم ها و آزمایش های مورد نظر می‏توان آنها را در لوله - ظروف پتری(پلیت)و یا ظروف دیگر مورد استفاده قرار داد . البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد.که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است.مثل SIM

 کشت های جامد در لوله را می‏توان به صورتهای زیر تهیه کرد :

۱. کشت های عمقی Stab Cultures :

حدود 5 الی 10 میلی لیتر از محیط کشت را در لوله آزمایش ریخته و به طور عمودی می‏گذارند تا محیط بسته شود. سپس میکروارگانیسمها را توسط سوزن کشت(آنس) به طور عمقی در مرکزاین محیط کشت می‏دهند . 

۲.کشت در داخل محیط جامد Shake Cultures:

به لوله‏های آزمایش محتوی محیط کشت جامد پس از ذوب شدن که تا 45 درجه سلسیوس سرد شده است. باکتری مورد نظر را افزوده و لوله را بین دستها تکان می‏دهندتا باکتریها کاملا با محیط کشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمایش را به طور عمودی قرار می‏دهند تا محیط بسته شود . 

۳.  کشت شیب دار Slant  Cultures:

حدود 5 میلی لیتر از محیط کشت جامد (ذوب شده) در لوله آزمایش و یا لوله‏های کوچک دیگر ریخته می‏شود و پس از سترون کردن آنها را به صورت کج به گونه‏ای می‏خوابانند که سطح محیط کشت شیب دار باشد . 

 میکروارگانیسمها را با سوزن کشت(آنس) در عمق و سطح و یا به وسیله فیلدوپلاتین نوک  حلقه‏ای ( لوپ ) در سطح شیب دار کشت می‏دهند.

کشت جامد در پلیت به سه صورت انجام می‏گیرد :

۱.کشت خطی در سطح محیط های جامد در ظرف پتری:

با این روش می‏توان میکروارگانیسم را بطور خطی توسط فیلدوپلاتین نوک حلقه‏ای (لوپ) در سطح محیط جامد کشت داد.

۲.  کشت در سطح محیط :

 در این روش توسط پی پت مقداری از رقت معینی از میکروارگانیسم را در سطح محیط جامد ریخته و با میله پخش کننده , کاملا در سطح محیط می‏گسترانند . 

۳.  کشت های دو لایه :

در این روش کشت مایع باکتری (سوسپانسیون باکتری) به محیط کشت ذوب شده (حرارت 45 درجه سلسیوس ) افزوده می‏شود. در صورت لزوم باکتری را با لایه نازکی از همان محیط کشت می‏پوشانند و پس از بسته شدن محیط ظرفهای پتری را به طور واژگون در گرمخانه قرار می‏دهند تا از ریختن قطرات آب درسطح محیط جلوگیری گردد . 

انواع محیط های کشت:

محیط های کشت را از نظر ترکیب شیمیایی و دارا بودن مواد غذائی یا مواد باز دارنده می‏توان به چند دسته تقسیم کرد . 

 ۱. محیط کشت انتخابی (Selective) :

 این محیط ها برای جدا کردن یک یا دسته‏ای از میکروارگانیسم‏ها بکار می‏روند و به علت دارا بودن مواد بازدارنده، از رشد میکروارگانیسم‏های ناخواسته جلوگیری می‏کنند مانند محیط  برد بارکر جهت جدا کردن استافیلوکوکوس اورئوس و یا محیط S.S برای سالمونلا و شیگلا و یا محیط دارای نمک های صفراوی برای جدا کردن کلی فرمها .

2.محیط های کشت غنی کننده (Enrichment) :

 این محیط ها معمولا در مواردی به کار می‏روند که تعداد میکروارگانیسم مورد جستجو   درنمونه غذائی کم بوده و یا به علت وجود زیاد میکروارگانیسم‏های دیگر جدا کردن آن با اشکال مواجه باشد.این محیط ها با ترکیب خاص خود از نظر pH و مواد غذائی امکان رشد برای میکروارگانیسم مورد نظر را فراهم می‏کند،مانند محیط گوشت پخته برای جدا کردن استافیلوکوکوس اورئوس . 

۳.محیط های کشت افتراقی (Differential) :

 محیط هایی هستند که میکروارگانیسم‏های مختلف در آن ویژگیهای خاص خود را نشان می‏دهند , مانند محیط های خون دار که در آن نمونه‏های همولیتیک و غیر همولیتیک از هم جدا می‏شوند .و محیط مک کانکی آگار که در آن کلی فرمهای تخمیر کننده لاکتوز پرگنه‏های قرمز می‏دهند . در حالی که باکتریهای روده‏ای که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند مانند سالمونلا پرگنه‏های بی رنگ به وجود می‏آورند . 

معرفی برخی از محیط های کشت مورد استفاده:

1. Blood agar

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیط های کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتری ها راتامین می کند وهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید.در این محیط برخی دارای همولیز آلفا(ناقص)و برخی بتا(کامل) و برخی گاما(فاقد همولیز)میباشند .نوع همولیز استاف اورئوس بتا میباشد یعنی همولیز کامل.این محیط محیط مناسبی برای هموفیلوس ها نیز می باشد.

2. E.M.B

ائوزین متیلن بلو آگار نوعی محیط کشتی است که برای تشخیص و جداسازی باکتری های میله ای روده ای گرم منفی استفاده می شود. همچنین ائوزین متیلن بلو آگار مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شود.ولی برخی گرم مثبت ها مانند استافیلوکوک های گواگولاز مثبت و برخی مخمر ها (کاندیدا آلبیکنس) می توانند در این محیط رشد کنند. مبنای افتراق در این محیط بکارگیری دو رنگ شاخص یعنی ائوزین و متیلن بلواست که متمایزکننده تخمیرکننده های لاکتوز ازارگانیسمهای فاقد توانایی تخمیر لاکتوز می باشد. در این محیط باکتری های تخمیر کننده لاکتوز دارای کلنی هایی قرمز پر رنگ و ارغوانی تا بنفش خواهند بود در حالیکه ارگانیسم هایی که نمی توانند لاکتوز را تخمیرکنند کلنی های کاملا بی رنگ یا هم رنگ محیط  خواهند داشت.E.coliدر این محیط جلای سبز فلزی خواهد داشت.

3.Hekton  Enteric agar

هکتون انتریک آگار محیطی انتخابی برای جداسازی و ترمیم نمونه های مدفوعی متعلق به باکتری های روده ای به ویژه سالمونلا و شیگلا است. این محیط  باکتری های تخمیرکننده لاکتوز را از آنهایی که نمی توانند از تخمیر لاکتوز ، اسید تولید کنند با ایجاد رنگ زرد - نارنجی روی محیط مناسب در حضور شاخص pH متمایز می کند . باکتری هایی که لاکتوز راتخمیر نمی کنند، روی محیط تغییر رنگ ایجاد نمی دهند. هکتون انتریک آگارمی تواند تولید گاز هیدروژن سولفید را با تیره نمودن بخش هایی از محیط  نشان دهد.

4. Mackonkey agar

مک کانکی آگار محیطی جامد برای متمایز کردن جمعیت زیادی ازمیکروبها است.این محیط اهمیت کاربردی زیادی در شناسایی تخمیرکننده های لاکتوز، پاتوژن های روده ای گرم منفی دارد.این محیط شامل پپتون, بافر,لاکتوز,کریستال ویوله,املاح صفرابی و معرف نوترال رد است که مانع رشد باکتریهای گرم مثبت می شود. کلنی باکتری های تخمیرکننده لاکتوز،محیط را به رنگ قرمز درمی آورند.رنگ قرمز درنتیجه ایجاد محیط اسیدی بوسیله تخمیر کننده های لاکتوز شکل می گیرد.ارگانیسم هایی که نمی توانند لاکتوز را تخمیر کنند، سبب تغییر رنگ نمی شوند.در واقع همرنگ با محیط می شوند.

5.Mannitol salt agar

یک  محیط انتخابی برای تمایز استافیلوکوکهای پاتوژن مانیتول سالت آگار است. غلظت بالای نمک(7.5%) در این محیط مانع از رشد بیشتر میکروارگانیسمها می شود.نه تنهااستافیلوکوک های پاتوژن می توانند در این محیط رشد کنند بلکه آنها در این محیط اسید هم تولید می کنند.این اسید تولید شده به عنوان شاخصpH موجب تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد می شود. استافیلوکوک های غیر باتوژن نیز قادر به رشد در این محیط هستند ولی نمی توانند اسید تولید کرده رنگ آن را تغییر دهند.

6. Mueller Hinton agar  

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید.

7.S I M Medium  

 محیطی نیمه جامد که از این محیط برای بررسی حرکت باکتری, توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 ,تست اندول استفاده می شود.

8.Salmonella shigelle agar ….SS agar

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت و بسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کند و به عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا و شیگلا بخصوص از نمونه مدفوع بسیار مناسب است.این محیط حاوی عصاره گوشت ,لاکتوز ,پپتون ,املاح صفراوی ,برلیانت گرین ,سیترات ,آگار ,تلوریت سدیم یا پتاسیم, و معرف نوترال رد است.

9. TSI.......Triple sugar iron agar

این محیط حاوی سه قند گلوگز و لاکتوز و سوکروز است با این تفاوت که میزان گلوگز آن 1%میزان دو قند دیگر است.علاوه بر این قند ها این محیط حاوی پپتون ,تیو سولفات,آهن,آگار,بافر و معرف فنل رد است.روش کشت در این محیط به صورت عمقی و خطی است. و از این محیط برای نشان دادن تخمیر قند ها و تولید CO2,H2S استفاده می شودو نتایج در دو بخش سطح و عمق لوله مورد بررسی قرار می گیرد.و به صورت اسیدی و قلیایی گزارش می شود.باکتری از قند استفاده کرده باشد تمام لوله اسیدی و به رنگ زرد دیده می شود و درغیر این صورت تمام لوله قلیا یی و قرمز خواهد بود.اسیدی شدن را با حرف A و قلیایی شدن را با Alk نشان می دهیم.

A/A:تمام لوله زرد است و باکتری تمام قند را مصرف کرده و سبب اسیدی شدن محیط شده است.

Alk/A:این حالت در طی 72 ساعت نشان دهنده مصرف تنها گلوگز است و بقیه قند ها مصرف نشده اند.

Alk/Alk :هیچ قندی مصرف نشده و محیط تغییر رنگ نمی دهد و شرایط قلیایی است.

اگر باکتری در این محیط قادر به استفاده از تیو سولفات سدیم باشد H2S  تولید می کندکه با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ خواهد داد. همچنین اگر تخمیر قندبا تولید CO2 همراه باشد,حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط را خواهیم داشت.

10.Lysine iron agar  

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دآمیناسیون لیزین استفاده می شود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود.

11. Kligleriron agar 

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود .

12. Dnase test agar

در این محیط  فعالیت آنزیم  دزوکسی ریبو نوکلئاز بررسی می شود.این آنزیم به پیوند های DNA حمله می کند این آنزیم یک آنزیم خارج سلولی است که مقاوم به حرارت بوده و برای شناسایی برخی باکتری ها مثل استاف اوروئوس می توان از این محیط استفاده کرد.                     

13. Endo agar

محیط جامدی است برای جدا سازی کلی فرم ها و سایر باسیل های روده از آب و غذا و سایر نمونه های کلینیکی.

14.  Bile Esculine agar

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرا برای شناسایی انتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرا به برخی از استرپتوکوکها ازجمله انتروکوک اجازه رشد می دهد وباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شود و در صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکز و اسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می شود.

15.MR VP

محیط مایع و حاوی گلوگز است .حال اگر باکتری قادر باشد گلوگز را از راه Mixed acid تجزیه کند اسید حاصله با PH:4-4.5 با معرف متیل رد به رنگ قرمز در می آید.ولی اگر باکتری گلوگز را از راه بوتان دیول تجزیه کند و محصول آن تر کیب حد واسطی مانند استوئین باشد که PH:6-6.5 دارد به معرف متیل رد جواب نمی دهد ولی با محلول پتاس 40% و آلفا نفتول کمپلکس قرمز رنگی ایجاد می کند.